PCR-fecesonderzoek bij gastro-enteritis

Vier microbiologische laboratoria hebben het onderzoek uitgevoerd: Isala (Zwolle), LabMicta (Enschede), Streeklaboratorium Kennemerland (Haarlem) en Izore (Leeuwarden). In 2010 spraken zij af dat ieder laboratorium zou proberen fecesmonsters van 500 patiënten en 500 controles uit huisartsenpraktijken in de eigen regio in te brengen. De huisartsen konden blijven werken op dezelfde manier als zij altijd al deden. Huisartsen die besloten een fecesmonster in te sturen voor onderzoek op bacteriële of parasitaire verwekkers van gastro-enteritis, vroegen de patiënt mee te doen met het onderzoek en een vragenformulier in te vullen. De vragen betroffen leeftijd, geslacht, buitenlandse reizen, gezinsleden met klachten van gastro-enteritis, gebruik van antacida en antibiotica, en voor de patiënten: duur van de diarree, koorts, braken, buikpijn en slijm of bloed bij de ontlasting.

De onderzoekers vroegen de huisarts in kwestie om in dezelfde periode een patiënt te zoeken van dezelfde leeftijd en hetzelfde geslacht die geen klachten had van gastro-enteritis, geen mensen met gastro-enteritis in de omgeving had en in de voorgaande twee weken geen antibiotica had gebruikt. Omdat al snel bleek dat het includeren van deze controlepersonen lastiger was dan gehoopt, nodigden de onderzoekers in elke regio ook voor leeftijdscategorie en geslacht gematchte, gezonde vrijwilligers uit die aan de inclusievoorwaarden voldeden. Ook de controlepersonen leverden een vers fecesmonster in en vulden het vragenformulier in.

Het onderzoek werd goedgekeurd door de medisch-ethische commissie van het UMCG onder de voorwaarde dat de uitslag van het fecesonderzoek niet bekendgemaakt zou worden aan de controlepersonen.

De monsters werden gealiquoteerd, bij –80 °C opgeslagen en geanalyseerd met multiplex real-time PCR. Om te voorkomen dat de analysemethoden die de verschillende laboratoria gebruikten van invloed zouden zijn op de uitkomst van het onderzoek, werd deze analyse dubbel uitgevoerd op een centraal laboratorium. De hier gepresenteerde resultaten zijn gebaseerd op de uitkomsten van het centrale laboratorium. Voor uitgebreide informatie over methode, primers en probes voor de real-time PCR’s verwijzen wij naar de oorspronkelijke publicatie.4

Bij elke analyse werd als interne controle het zeehondherpesvirus aan het fecesmonster toegevoegd. Daarnaast werd gezocht naar Campylobacter spp., Salmonella spp., pathogene Yersinia enterocolitica, toxigene Clostridium difficile, Shigella spp. en entero-invasieve Escherichia coli (EIEC), enterohemorragische E. coli (EHEC), shigatoxineproducerende E. coli (STEC), Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum en Cryptosporidium hominis, Dientamoeba fragilis, enterotoxigene E. coli (ETEC), enteroaggregative E.coli (EAEC), atypische en typische enteropathogene E.coli (aEPEC en tEPEC).

Voor de verwerking van de data is SPSS versie 18 gebruikt. Dichotome variabelen werden berekend met de exacte toets van Fisher, voor categoriale variabelen met meer dan twee categorieën gebruikten we de chikwadraattoets of de exacte toets van Fisher indien het om kleine groepen ging. Continue variabelen analyseerden we met de Mann-Whitney-U-toets. Als maat voor significantie hielden we een waarschijnlijkheid aan van 95% (p-waarde 0,05).

Men mag verwachten dat micro-organismen die gastro-enteritis veroorzaken vaker worden aangetroffen in de feces van patiënten dan in die van gezonde personen. Voor de meeste micro-organismen die wij onderzochten klopt dat ook, behalve voor STEC en tEPEC. Opvallend zijn onze bevindingen inzake Dientamoeba fragilis. Deze parasiet wordt sinds de invoering van de TFT heel veel gevonden in de ontlasting van kinderen met buikpijn en wordt sindsdien om die reden ook vaak behandeld.5 Wij troffen D. fragilis bij patiënten echter juist significant minder vaak en in lagere hoeveelheden aan dan bij gezonde controlepersonen. In een eerder Nederlands onderzoek op basis van microscopie werd D. fragilis ook al vaak aangetroffen bij patiënten én bij controlepersonen, maar was het verschil niet significant.6 Al met al was deze uitkomst voor drie van de vier deelnemende laboratoria reden om D. fragilis niet langer als darmpathogeen te beschouwen en niet langer te screenen op de aanwezigheid van deze parasiet in de feces van patiënten met gastro-enteritis. Een recent gerandomiseerd, dubbelblind placebogecontroleerd onderzoek naar de effectiviteit van metronidazol bij buikpijn ondersteunt dit standpunt: metronidazol had geen significant beter effect op de klachten dan placebo, terwijl bij veel deelnemers D. fragilis niet meer gedetecteerd werd.7 Ook een ander recent Nederlands onderzoek vond geen steun voor de rol van D. fragilis bij chronische buikpijn.8

Een andere opvallende bevinding betrof STEC. Er is een aangifteplicht voor gastro-enteritis door STEC, onder groep B2. In 2012 nog overleden in Duitsland vijftig mensen aan een voedselgerelateerde STEC-uitbraak. Het verschil was weliswaar net niet significant, maar in de feces van patiënten vonden wij minder vaak STEC dan in de feces van gezonde controlepersonen. Wij denken dat de detectie van stx1- en stx2-genen met PCR te weinig differentieert om pathogene vormen van STEC op te sporen. Er is onderzoek gaande dat wijst op het bestaan van specifieke STEC-pathotypes die geassocieerd zijn met ernstige gastro-enteritis en die zelfs het hemolytisch-uremisch syndroom kunnen veroorzaken. Het is duidelijk dat alleen deze pathotypes aan de GGD gemeld zouden moeten worden.

Opvallend was verder dat sommige micro-organismen, zoals G. lamblia en C. difficile, alleen in bepaalde leeftijdscategorieën een hogere prevalentie hadden. Giardia wordt toch echt als een darmpathogeen beschouwd waarvan vooral kinderen last hebben, maar wij vonden alleen een significant verschil bij patiënten ouder dan 50 jaar, niet bij patiënten jonger dan 20 en ook niet bij kinderen onder de 5. Kennelijk is er sprake van veel asymptomatisch dragerschap van G. lamblia bij kinderen.

Een vergelijkbaar beeld zien we voor C. difficile. Bekend is dat kleine kinderen, in tegenstelling tot ouderen, vaak drager zijn van C. difficile zonder dat zij klachten hebben.9 Ons onderzoek bevestigde dit: wij troffen C. difficile in de leeftijdsgroep C. difficile gezien worden, was het verschil wel significant en kwam asymptomatisch dragerschap niet voor. Opnieuw een aanwijzing dat men omzichtig moet omspringen met PCR-resultaten.

Bij aanvang hoopten we dat ons onderzoek uitsluitsel zou kunnen geven of, bij een positieve uitslag van de PCR, de Ct-waarde voorspellend zou zijn voor gastro-enteritis. Er wordt wel gezegd dat de PCR-uitslag alleen klinische betekenis heeft wanneer de Ct-waarde onder een bepaalde grens blijft en de hoeveelheid aangetroffen DNA dus groot genoeg is. In ons onderzoek blijkt zo’n duidelijke tweedeling er alleen te zijn voor Salmonella en ETEC, met bij alle patiënten een Ct-waarde ≤ 33. Voor Salmonella spp en ETEC, maar ook voor Campylobacter spp en Cryptosporidium parvum/hominis, vonden wij in alle leeftijdscategorieën significant lagere Ct-waarden bij patiënten, maar zagen we incidenteel ook een lage Ct-waarde bij controlepersonen. Voor Clostridium difficile, EAEC en aEPEC ligt het nog complexer: we vonden alleen verschillen in bepaalde leeftijdscategorieën. En bij STEC en D. fragilis vonden wij juist omgekeerde verschillen: patiënten hadden hogere Ct-waarden.

Ons onderzoek maakt duidelijk dat PCR-uitslagen een genuanceerde interpretatie vereisen. Het simpele ‘positief’ of ‘negatief’ geeft geen adequaat antwoord op de vraag of de klachten veroorzaakt worden door die bepaalde bacterie of parasiet. Ook een min of meer kwantitatieve uitslag zoals de Ct-waarde laat lang niet altijd een eenduidige interpretatie toe. De interpretatie van de PCR-uitslag, en dus de terugkoppeling naar de aanvrager – in het geval van gastro-enteritis is dat bijna altijd de huisarts – blijft maatwerk.

Ondanks deze nuancering heeft de introductie van de PCR in de praktijk vooral voordelen opgeleverd, met name een vermindering van het aantal onnodige coloscopieën. PCR-fecesdiagnostiek is zeer sensitief en de methode is bij aanvragende huisartsen al zo bekend dat fecesonderzoek binnen één ziekteperiode zelden meer herhaald hoeft te worden. Eén van de vier deelnemende laboratoria doet voor patiënten met bloederige diarree ook in het weekend PCR-onderzoek en koppelt een positief testresultaat actief terug naar de huisarts.

In Nederland is eerder patiënt-controleonderzoek gedaan naar verwekkers van gastro-enteritis, toen nog vooral met kweek en microscopie.6 Opmerkelijk is dat in dat onderzoek dezelfde percentages positieve fecesmonsters gevonden werden als in ons onderzoek met de veel sensitievere PCR-methode (met uitzondering van Shigella/EIEC, C. parvum/hominis en D. fragilis). 2 Dat wijst erop dat salmonellose en campylobacteriose minder vaak voorkomen, wellicht als gevolg van betere hygiëne en grotere alertheid bij de voedselbereiding, thuis en in de voedingsindustrie.2 Een recent rapport van de European Food and Safety Authority bevestigt deze hoopvolle ontwikkeling.10